седиментация макромолекул. ультрацентрифугирование

Содержание

Введение

1⠄Теоретические основы седиментации макромолекул и ультрацентрифугирования
1⠄1⠄Основные понятия и физические принципы седиментации макромолекул
1⠄2⠄Ультрацентрифугирование как метод исследования: история, типы ультрацентрифуг и их устройство
1⠄3⠄Теоретические подходы к анализу седиментационного поведения: уравнение Сведберга, коэффициенты седиментации и диффузии

2⠄Практическое применение метода $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$
2⠄$⠄$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$: $$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$
2⠄2⠄$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$: $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$
2⠄$⠄$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$

$$$$$$$$$$

$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$

Введение

Изучение свойств макромолекул является фундаментальной задачей современной химии, биофизики и материаловедения, поскольку именно полимерные цепи составляют основу как биологических тканей, так и множества синтетических материалов, используемых в промышленности и медицине. Одним из наиболее информативных и точных методов анализа молекулярных характеристик высокомолекулярных соединений является ультрацентрифугирование, основанное на явлении седиментации макромолекул в сильном гравитационном поле. Данный метод позволяет не только определять молекулярные массы и их распределение, но и изучать конформационные изменения, межмолекулярные взаимодействия и процессы ассоциации в растворах. Актуальность темы обусловлена необходимостью получения надежных данных о структуре и поведении макромолекул для разработки новых полимерных материалов с заданными свойствами, а также для углубленного понимания молекулярных механизмов функционирования биополимеров, таких как белки и нуклеиновые кислоты.

Проблематика исследования заключается в сложности интерпретации экспериментальных данных седиментационного анализа, которая требует учета множества факторов: неидеальности растворов, зависимости коэффициента седиментации от концентрации и формы макромолекул, а также влияния гидродинамических и термодинамических эффектов. Кроме того, существует необходимость в систематизации современных подходов к проведению ультрацентрифужного эксперимента и методов обработки его результатов для обеспечения воспроизводимости и достоверности получаемых характеристик.

Объектом исследования в данной курсовой работе является процесс седиментации макромолекул в растворах под действием центробежных сил. Предметом исследования выступают теоретические основы и практические методы ультрацентрифугирования, применяемые для анализа $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ и $$$$$$$$$$$$.

$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$.

$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$:
$) $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$;
$) $$$$$$$$$$$ $$$$$$-$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$;
$) $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$;
$) $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$;
$) $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$.

$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$: $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$-$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$ $. $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$.

$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$, $ $$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$-$$$$$$$$$$ $$$.

Основные понятия и физические принципы седиментации макромолекул

Седиментация макромолекул представляет собой процесс направленного перемещения частиц дисперсной фазы в жидкой среде под действием гравитационных или центробежных сил. В отличие от низкомолекулярных соединений, для которых броуновское движение существенно преобладает над силами гравитации, макромолекулы и коллоидные частицы обладают достаточной массой, чтобы под действием внешнего поля происходило их концентрирование в определенной области объема раствора. Данное явление лежит в основе целого класса аналитических методов, объединяемых общим названием седиментационный анализ, и имеет ключевое значение для определения молекулярно-массовых характеристик полимеров и биополимеров [12].

Физическая сущность процесса седиментации описывается балансом сил, действующих на макромолекулу в вязкой среде. При вращении ротора ультрацентрифуги на частицу действуют три основные силы: центробежная сила, направленная от оси вращения; сила Архимеда, обусловленная вытеснением растворителя; и сила вязкого трения, возникающая при движении частицы через жидкость. Центробежная сила пропорциональна массе частицы, расстоянию от оси вращения и квадрату угловой скорости. Сила Архимеда определяется массой вытесненного растворителя и направлена противоположно центробежной силе. Результирующая сила, вызывающая движение частицы, равна разности между центробежной силой и силой Архимеда и пропорциональна эффективной массе частицы, то есть ее массе за вычетом массы вытесненного растворителя.

Скорость седиментации макромолекул зависит от их размера, формы и плотности, а также от вязкости и плотности растворителя. Для сферических частиц в рамках закона Стокса сила трения пропорциональна радиусу частицы, вязкости среды и скорости ее движения. По мере увеличения скорости движения возрастает и сила трения, пока она не уравновесит результирующую центробежную силу. В этот момент частица начинает двигаться с постоянной скоростью, которая называется скоростью седиментации. Данное состояние динамического равновесия является ключевым для понимания количественных закономерностей процесса.

Важнейшей характеристикой процесса седиментации является коэффициент седиментации, который определяется как отношение скорости седиментации к центробежному ускорению. Коэффициент седиментации не зависит от скорости вращения ротора и расстояния от оси вращения, а определяется исключительно свойствами макромолекулы и среды. Размерность коэффициента седиментации в системе СИ выражается в секундах, однако в практике ультрацентрифугирования традиционно используется единица Сведберга, равная 10-13 секунды. Коэффициент седиментации является фундаментальной характеристикой макромолекулы, позволяющей оценивать ее молекулярную массу, гидродинамический радиус и степень асимметрии.

Современные представления о седиментации макромолекул базируются на уравнениях необратимой термодинамики и гидродинамики растворов полимеров. В последние годы российскими исследователями активно развиваются подходы, учитывающие неидеальность растворов и эффекты $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ седиментации. $$$, $ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ В.$. $$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ растворов полимеров $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ седиментации $$ $$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ [$$]. $$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$.

$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$ $ $ $$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$-$$ $$ $$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$, $ $$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ — $$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$-$$ $$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$ $.

$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$.

$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$. $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$, $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ [$$]. $$$$$$$$$$$, $$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$ $ $$$-$$$ $$$$ $$$$$$, $$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$.

Седиментация макромолекул в растворе неразрывно связана с процессами диффузии, которая всегда стремится выровнять концентрационные градиенты, возникающие в результате действия центробежных сил. Именно баланс между седиментацией и диффузией определяет характер распределения макромолекул в ячейке ультрацентрифуги и позволяет различать два основных режима проведения эксперимента: скоростную седиментацию и седиментационное равновесие. В режиме скоростной седиментации создается достаточно сильное центробежное поле, при котором макромолекулы движутся к дну ячейки с образованием четкой границы между раствором и чистым растворителем. Скорость перемещения этой границы позволяет непосредственно рассчитывать коэффициент седиментации. Данный метод особенно эффективен для определения молекулярных масс однородных полимеров и исследования процессов ассоциации макромолекул.

В отличие от скоростной седиментации, метод седиментационного равновесия основан на установлении динамического равновесия между седиментацией и диффузией при относительно невысоких скоростях вращения ротора. В этом случае распределение концентрации макромолекул по радиусу ячейки описывается экспоненциальной функцией, параметры которой зависят от молекулярной массы, парциального удельного объема макромолекул и плотности растворителя. Метод седиментационного равновесия позволяет определять молекулярные массы без привлечения данных о коэффициенте диффузии, что является его важным преимуществом. Однако для достижения равновесия требуется длительное время центрифугирования, которое может составлять от нескольких часов до нескольких суток в зависимости от молекулярной массы исследуемого полимера.

Важным аспектом теории седиментации является учет неидеальности растворов полимеров. В реальных растворах макромолекулы взаимодействуют друг с другом, что приводит к зависимости коэффициента седиментации от концентрации. Это взаимодействие может быть как притяжением, так и отталкиванием, в зависимости от природы полимера и растворителя, а также от температуры. Для корректного определения молекулярных масс необходимо проводить измерения при нескольких концентрациях и экстраполировать полученные значения коэффициента седиментации к нулевой концентрации. Теоретическое описание концентрационной зависимости коэффициента седиментации базируется на теории вириальных разложений и учитывает как гидродинамические, так и термодинамические эффекты [27].

Современные исследования в области седиментации макромолекул все чаще обращаются к изучению полимеров сложной архитектуры, включая гребнеобразные, циклические и сверхразветвленные структуры. Для таких макромолекул классические теории седиментации, разработанные для линейных цепей, требуют существенной модификации. В работах российских ученых из Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова было показано, что коэффициент седиментации циклических полимеров примерно на 15-20 процентов меньше, чем для линейных аналогов той же молекулярной массы, что объясняется более компактной конформацией циклов. Данное различие может быть использовано для идентификации топологии полимерных цепей в смешанных образцах.

Особую роль в теории седиментации играет понятие парциального удельного объема макромолекул, который представляет собой объем, занимаемый одним граммом полимера в растворе. Эта величина необходима для расчета эффективной массы макромолекулы с учетом вытеснения растворителя и определяется экспериментально с помощью пикнометрии или денситометрии. Парциальный удельный объем зависит от химической природы полимера, его конформации и степени сольватации. Для большинства синтетических полимеров в органических растворителях парциальный удельный объем составляет от 0,7 до 1,1 кубического сантиметра на грамм, тогда как для белков в водных растворах он обычно находится в диапазоне от 0,70 до 0,75 кубического сантиметра на грамм.

Гидродинамические свойства макромолекул, определяющие их седиментационное поведение, тесно связаны с конформацией полимерной цепи в растворе. В хороших растворителях макромолекулы набухают и принимают более вытянутую конформацию, что приводит к увеличению коэффициента трения и уменьшению скорости седиментации. В тета-растворителях, где взаимодействие полимера с растворителем уравновешено внутримолекулярными взаимодействиями, макромолекулы ведут себя как идеальные гауссовы клубки. Переход между $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$, $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$, $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$.

$ $$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $ $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$ [$].

$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $, $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$, $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$.

Ультрацентрифугирование как метод исследования: история, типы ультрацентрифуг и их устройство

Ультрацентрифугирование представляет собой метод разделения и анализа макромолекул, основанный на их седиментации в центробежном поле высокой интенсивности. История развития данного метода начинается с работ шведского ученого Теодора Сведберга, который в 1923 году сконструировал первую аналитическую ультрацентрифугу и удостоился за это Нобелевской премии по химии в 1926 году. Сведберг впервые продемонстрировал, что белки являются высокомолекулярными соединениями с четко определенной молекулярной массой, что опровергло господствовавшие в то время представления о коллоидной природе белковых растворов. Его исследования заложили фундамент современной молекулярной биофизики и полимерной науки.

В России развитие ультрацентрифугирования связано с работами выдающихся ученых, среди которых особое место занимает В.Н. Цветков, создавший отечественную школу гидродинамических методов исследования полимеров. Под его руководством были разработаны теоретические основы седиментационного анализа для жесткоцепных и жидкокристаллических полимеров, а также созданы первые отечественные модели аналитических ультрацентрифуг. Дальнейший вклад в развитие метода внесли исследования В.И. Кленина, С.Я. Френкеля и других ученых, которые адаптировали ультрацентрифугирование для изучения синтетических полимеров и биополимеров в различных растворителях [6].

Современные ультрацентрифуги подразделяются на два основных типа: аналитические и препаративные. Аналитические ультрацентрифуги предназначены для изучения седиментационного поведения макромолекул в реальном времени и оснащены оптическими системами регистрации распределения концентрации в ячейке. Препаративные ультрацентрифуги используются для разделения и выделения фракций макромолекул в количествах, достаточных для дальнейшего анализа. Существуют также комбинированные системы, позволяющие проводить как аналитические, так и препаративные эксперименты.

Устройство современной аналитической ультрацентрифуги включает несколько ключевых компонентов: ротор с ячейками, высокоскоростной привод, систему охлаждения и вакуумную систему, а также оптическую систему регистрации. Ротор изготавливается из высокопрочных титановых или алюминиевых сплавов и рассчитан на работу при скоростях до 60 000-80 000 оборотов в минуту. Ячейки для образцов имеют специальную конструкцию, позволяющую наблюдать за процессом седиментации через кварцевые или сапфировые окна. Вакуумная система необходима для уменьшения нагрева ротора за счет трения о воздух и предотвращения конвекционных потоков в ячейках.

Оптические системы регистрации являются важнейшим элементом аналитической ультрацентрифуги и определяют точность и информативность $$$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$: $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$$ и $$$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$ и $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ и $$$$$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$, $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$. $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$.

$ $$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$, $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ [$$].

$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$: $$$$$$$, $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$. $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$ $ $$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$, $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$ $ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$.

Особое место в современном ультрацентрифугировании занимают методы градиентного центрифугирования, которые широко используются для разделения и анализа биологических макромолекул и надмолекулярных комплексов. В основе этих методов лежит создание в центрифужной пробирке градиента плотности с помощью таких веществ, как сахароза, хлорид цезия или перколл. При центрифугировании макромолекулы мигрируют в градиенте до тех пор, пока не достигнут зоны, где их плотность равна плотности окружающей среды. Данный подход позволяет разделять макромолекулы с очень близкими значениями плотности и коэффициентов седиментации, что невозможно при использовании обычных методов осаждения.

В изопикническом центрифугировании, являющемся разновидностью градиентного метода, разделение происходит исключительно по плотности частиц, а не по их размеру. Этот метод особенно эффективен для разделения нуклеиновых кислот, поскольку плотность ДНК и РНК различается достаточно сильно. Кроме того, изопикническое центрифугирование в градиенте хлорида цезия позволяет разделять фрагменты ДНК с различным содержанием гуанин-цитозиновых пар, что используется в молекулярной биологии для анализа геномов. Российскими исследователями из Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН были разработаны модификации данного метода, позволяющие проводить разделение при более низких скоростях вращения за счет использования градиентов с высокой разрешающей способностью [14].

Зональное центрифугирование представляет собой метод, в котором образец наносится тонким слоем на поверхность предварительно сформированного градиента плотности. При центрифугировании компоненты образца движутся через градиент с различными скоростями в зависимости от их коэффициентов седиментации. Данный метод позволяет получать узкие зоны очищенных макромолекул и широко используется для препаративного выделения рибосом, вирусов и субклеточных органелл. В работах сотрудников Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН было показано, что оптимизация параметров зонального центрифугирования позволяет повысить выход целевых продуктов до 95 процентов при сохранении их нативной структуры.

Современные ультрацентрифуги оснащаются сложными системами управления и сбора данных, которые позволяют автоматизировать процесс эксперимента и минимизировать влияние человеческого фактора. Микропроцессорные контроллеры обеспечивают точное поддержание заданной скорости вращения, температуры и времени центрифугирования, а также позволяют программировать многоступенчатые протоколы с изменением параметров в ходе эксперимента. Системы сбора данных регистрируют оптические сигналы с частотой до нескольких тысяч измерений в секунду, что обеспечивает высокое временное разрешение при изучении быстрых седиментационных процессов.

Важным направлением развития ультрацентрифугирования является создание специализированных ячеек и роторов для решения конкретных исследовательских задач. Например, ячейки с синтетической границей позволяют формировать четкую начальную границу между раствором и растворителем непосредственно в роторе, что повышает точность измерений коэффициентов седиментации. Ячейки с несколькими каналами дают возможность одновременно анализировать до семи образцов в идентичных условиях, что существенно ускоряет сравнительные исследования. Разработка таких специализированных ячеек ведется в Институте высокомолекулярных соединений РАН, где созданы конструкции, адаптированные для работы с агрессивными растворителями и при высоких температурах [30].

Безопасность работы с ультрацентрифугами является критически важным аспектом, учитывая огромные кинетические энергии, запасенные $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ с $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, является $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$. $$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$. $$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$-$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$. $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$ $ $$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$-$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ [$].

$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$ $$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$.

Теоретические подходы к анализу седиментационного поведения: уравнение Сведберга, коэффициенты седиментации и диффузии

Фундаментальной основой количественного анализа седиментационного поведения макромолекул является уравнение Сведберга, которое связывает коэффициент седиментации с молекулярной массой и гидродинамическими характеристиками макромолекулы. Данное уравнение было выведено Теодором Сведбергом в 1920-х годах и с тех пор остается краеугольным камнем теории ультрацентрифугирования. Уравнение Сведберга имеет вид M = (sRT) / (D(1 - vρ)), где M представляет собой молекулярную массу, s - коэффициент седиментации, D - коэффициент диффузии, R - универсальную газовую постоянную, T - абсолютную температуру, v - парциальный удельный объем макромолекулы, а ρ - плотность растворителя. Данное соотношение позволяет определять молекулярную массу макромолекул на основе независимых измерений коэффициентов седиментации и диффузии.

Коэффициент седиментации s определяется как отношение скорости седиментации макромолекулы к центробежному ускорению и имеет размерность времени. В практике ультрацентрифугирования принято выражать коэффициент седиментации в единицах Сведберга, обозначаемых символом S, где 1 S соответствует 10^-13 секунды. Значения коэффициентов седиментации для различных макромолекул варьируются в широких пределах: от 1-2 S для небольших пептидов до 50-100 S для крупных белковых комплексов и вирусных частиц. Для синтетических полимеров характерны значения коэффициентов седиментации в диапазоне от нескольких единиц до нескольких десятков Сведберга в зависимости от молекулярной массы и конформации цепи.

Коэффициент диффузии D является мерой подвижности макромолекул в растворе и определяется их гидродинамическим радиусом и вязкостью среды. Согласно уравнению Стокса-Эйнштейна, коэффициент диффузии обратно пропорционален гидродинамическому радиусу макромолекулы. Комбинируя уравнение Сведберга с уравнением Стокса-Эйнштейна, можно получить выражение, связывающее коэффициент седиментации непосредственно с гидродинамическим радиусом макромолекулы, что позволяет оценивать размеры макромолекул без привлечения данных о коэффициенте диффузии. В работах российских исследователей из Института химии растворов имени Г.А. Крестова РАН было показано, что для жесткоцепных полимеров данная связь может быть существенно модифицирована из-за анизотропии гидродинамического сопротивления [5].

Парциальный удельный объем v является критически важным параметром в уравнении Сведберга, поскольку он определяет эффективную массу макромолекулы с учетом вытеснения растворителя. Для точного определения молекулярной массы необходимо знать парциальный удельный объем с высокой точностью, поскольку ошибка в его значении приводит к пропорциональной ошибке в рассчитанной молекулярной массе. Экспериментальное определение парциального удельного объема проводится методами пикнометрии или денситометрии при нескольких концентрациях полимера с последующей экстраполяцией к бесконечному разбавлению. Современные автоматические денситометры позволяют измерять плотность растворов с точностью до 10^-6 г/см^3, что обеспечивает высокую надежность определения парциального удельного объема.

Важным теоретическим подходом является анализ концентрационной зависимости коэффициента седиментации, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ = $$($ - $$), $$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ седиментации $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $ - $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $ $ - $$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$ $ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ коэффициента седиментации $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$ $$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$$$, $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ [$$]. $$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$, $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $ $$$$$ $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$. $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$.

$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $ $$ $$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$ [$$].

$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$.

Важным аспектом теоретического анализа седиментационного поведения является учет формы макромолекул и их конформационной гибкости. Для жестких палочкообразных макромолекул, таких как некоторые биополимеры и жидкокристаллические полимеры, коэффициент седиментации зависит не только от молекулярной массы, но и от отношения длины к диаметру частицы. Теоретические модели, разработанные для таких систем, учитывают анизотропию гидродинамического сопротивления и ориентационные эффекты в центробежном поле. В работах российских ученых из Института высокомолекулярных соединений РАН было показано, что для жесткоцепных полимеров зависимость коэффициента седиментации от молекулярной массы может отличаться от классической теории для гибкоцепных макромолекул, что необходимо учитывать при интерпретации экспериментальных данных.

Для гибкоцепных полимеров в хороших растворителях теоретическое описание седиментационного поведения основывается на скейлинговых концепциях и теории персистентной длины. Согласно скейлинговой теории, коэффициент седиментации связан с молекулярной массой степенным соотношением s = K * M^b, где показатель степени b зависит от качества растворителя и конформации макромолекулы. Для идеальных гауссовых цепей в тета-условиях показатель b равен 0,5, тогда как для набухших цепей в хороших растворителях он составляет приблизительно 0,4-0,45. Экспериментальное определение показателя b позволяет судить о конформационном состоянии макромолекул и качестве растворителя.

Метод скоростной седиментации является одним из наиболее распространенных подходов для определения коэффициентов седиментации и анализа молекулярно-массового распределения полимеров. В данном методе регистрируется перемещение границы между раствором и чистым растворителем в процессе центрифугирования. Скорость перемещения границы определяется коэффициентом седиментации, а ее размывание связано с диффузией и полидисперсностью образца. Анализ формы седиментационной границы позволяет получать информацию о распределении макромолекул по коэффициентам седиментации, которое может быть преобразовано в молекулярно-массовое распределение при известной зависимости s от M.

Современные методы обработки данных скоростной седиментации основаны на решении обратной задачи, то есть восстановлении распределения коэффициентов седиментации по экспериментально измеренным профилям концентрации. Для решения этой задачи используются различные математические подходы, включая метод регуляризации Тихонова, метод максимальной энтропии и методы на основе вейвлет-преобразований. В работах российских математиков из Института вычислительной математики имени Г.И. Марчука РАН были разработаны эффективные алгоритмы регуляризации, адаптированные для обработки данных ультрацентрифугирования, которые позволяют получать устойчивые решения даже при высоком уровне шума в экспериментальных данных [1].

Особое значение имеет теоретический анализ седиментации в условиях градиента плотности, который используется в изопикническом и зональном центрифугировании. В этих методах распределение макромолекул определяется не только их коэффициентом седиментации, но и плотностью, что позволяет разделять частицы с близкими размерами, но различной плотностью. Теоретическое описание седиментации в градиенте плотности требует учета изменения вязкости и плотности среды вдоль радиуса ячейки, а также эффектов диффузии в неоднородной среде. Разработка точных теоретических моделей для таких систем является актуальной задачей современной физики полимеров.

Метод седиментационного равновесия в градиенте плотности представляет собой комбинацию двух подходов и позволяет определять молекулярные массы и плотности макромолекул в одном эксперименте. В данном методе центрифугирование проводится до установления равновесия в предварительно сформированном градиенте плотности, после чего анализируется распределение макромолекул вдоль радиуса ячейки. Теоретический анализ таких экспериментов требует решения системы уравнений, описывающих как седиментационно-диффузионное равновесие, так и распределение $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ системы и $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ макромолекул.

$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$-$$$$$$$$$$$ $ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ [$$].

$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$-$$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$.

$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $ $$$$$ $$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$.

Методика проведения эксперимента по седиментации: подготовка образцов, режимы центрифугирования и регистрация данных

Проведение эксперимента по седиментации макромолекул методом ультрацентрифугирования требует тщательной подготовки на всех этапах, начиная с подготовки образцов и заканчивая регистрацией и первичной обработкой данных. Качество получаемых результатов напрямую зависит от соблюдения методических требований и учета множества факторов, способных повлиять на седиментационное поведение исследуемых макромолекул. В данном разделе рассматриваются основные этапы методики проведения седиментационного эксперимента, включая подготовку образцов, выбор режима центрифугирования и особенности регистрации данных с помощью различных оптических систем.

Подготовка образцов для ультрацентрифугирования начинается с выбора подходящего растворителя и буферной системы. Растворитель должен обладать достаточной растворяющей способностью по отношению к исследуемому полимеру, не вызывать его деградации или агрегации, а также иметь подходящую плотность и вязкость для обеспечения оптимальных условий седиментации. Для биологических макромолекул особенно важно поддержание физиологических значений pH и ионной силы, чтобы сохранить нативную конформацию и предотвратить денатурацию. В работах российских исследователей из Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН было показано, что использование трис-HCl буфера с добавлением хлорида натрия в концентрации 0,15 М обеспечивает стабильность большинства глобулярных белков в процессе ультрацентрифугирования [16].

Концентрация исследуемого образца является критически важным параметром, который необходимо тщательно подбирать для каждого конкретного эксперимента. Слишком высокая концентрация приводит к нежелательным эффектам неидеальности раствора, включая концентрационную зависимость коэффициента седиментации и образование агрегатов. Слишком низкая концентрация, в свою очередь, может не обеспечить достаточного сигнала для оптической системы регистрации. Оптимальный диапазон концентраций зависит от типа макромолекул и используемой оптической системы. Для абсорбционной оптики обычно используются концентрации, обеспечивающие оптическую плотность в диапазоне от 0,2 до 1,0 единиц при длине волны измерения. Для интерференционной оптики концентрации могут быть ниже, поскольку чувствительность этого метода выше.

Перед проведением эксперимента образцы необходимо подвергнуть тщательной очистке от низкомолекулярных примесей и агрегатов. Наиболее распространенным методом очистки является диализ против большого объема растворителя, который позволяет удалить низкомолекулярные компоненты и уравновесить химический потенциал растворителя. Для удаления крупных агрегатов и пылевых частиц образцы фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 или 0,45 микрометра. Особое внимание уделяется удалению пузырьков воздуха из образцов, поскольку они могут искажать оптические измерения и нарушать равномерность седиментации. Дегазация образцов проводится путем кратковременного центрифугирования при низкой скорости или вакуумирования.

Выбор режима центрифугирования определяется целями эксперимента и характеристиками исследуемых макромолекул. Для скоростной седиментации используются высокие скорости вращения ротора, обеспечивающие быстрое осаждение макромолекул и формирование четкой седиментационной границы. Скорость вращения выбирается таким образом, чтобы время полного осаждения макромолекул составляло от 30 минут до нескольких часов. Для седиментационного равновесия используются значительно более низкие скорости, при которых устанавливается динамическое равновесие между седиментацией и диффузией. Время достижения равновесия может составлять от нескольких часов до нескольких суток в зависимости от молекулярной массы исследуемых макромолекул и высоты столба раствора в ячейке.

Температурный контроль является обязательным условием проведения прецизионных седиментационных измерений. Современные ультрацентрифуги оснащены системами термостатирования, поддерживающими температуру с точностью до 0,1 градуса $$$$$$$. $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$, $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$$$$, $$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$ $$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $-$$ $$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ [$].

$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$.

$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$ [$$].

$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$.

$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$, $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$. $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$. $$$$$ $$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$ $ $$$$$$$$$ $$ $,$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$, $ $$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$.

Важным аспектом методики проведения седиментационного эксперимента является выбор типа ротора и ячеек в зависимости от поставленных задач. Для аналитического ультрацентрифугирования используются специальные роторы с двумя или тремя ячейками, одна из которых обычно содержит чистый растворитель и служит для калибровки оптической системы. Ячейки для аналитического центрифугирования имеют секторальную форму, которая обеспечивает равномерное распределение центробежных сил и предотвращает взаимодействие осаждающихся макромолекул со стенками ячейки. Конструкция ячеек предусматривает возможность использования различных оптических окон: кварцевых для работы в ультрафиолетовой области и сапфировых для работы в видимом диапазоне.

Процедура заполнения ячеек требует особой тщательности, поскольку наличие даже микроскопических пузырьков воздуха может существенно исказить результаты измерений. Заполнение проводится с помощью специальных шприцев с длинными иглами, которые позволяют вводить образец и растворитель непосредственно в полость ячейки без образования воздушных карманов. После заполнения ячейки герметизируются с помощью специальных винтовых заглушек, обеспечивающих надежное уплотнение при высоких скоростях вращения. Контроль герметичности осуществляется путем взвешивания ячеек до и после центрифугирования; изменение массы более чем на 0,5 миллиграмма свидетельствует о наличии утечки.

Балансировка ротора является критически важной операцией, от которой зависит безопасность работы ультрацентрифуги и качество получаемых данных. Ячейки с образцами и противовесы должны быть тщательно сбалансированы по массе с точностью до 0,1 грамма. Для точной балансировки используются специальные балансировочные кольца и грузики, которые устанавливаются в соответствующие гнезда ротора. Современные ультрацентрифуги оснащены автоматическими системами балансировки, которые компенсируют небольшие дисбалансы за счет активного управления приводом, однако полагаться исключительно на эти системы не рекомендуется.

После установки ротора в камеру центрифуги проводится вакуумирование для удаления воздуха и предотвращения нагрева ротора за счет трения. Вакуумная система современных ультрацентрифуг обеспечивает остаточное давление порядка 10^-2 миллиметров ртутного столба, что достаточно для эффективного теплоотвода и минимизации конвекционных потоков. После достижения рабочего вакуума включается система термостатирования, и ротор выдерживается при заданной температуре в течение 15-30 минут для установления теплового равновесия.

Запуск ротора и выход на рабочую скорость осуществляется в автоматическом режиме с контролем всех параметров процесса. Современные ультрацентрифуги позволяют программировать профиль разгона и торможения ротора, что особенно важно для предотвращения перемешивания образцов при резком изменении скорости. В ходе эксперимента система управления непрерывно контролирует скорость вращения, температуру и вакуум, а также регистрирует сигналы оптической системы. В случае возникновения нештатных ситуаций, таких как превышение допустимой температуры или дисбаланс ротора, система автоматически останавливает вращение.

Регистрация данных в процессе скоростной седиментации проводится с заданной периодичностью, которая выбирается в зависимости от ожидаемой скорости седиментации. Для быстрых процессов с временем полного осаждения 30-60 минут сканирование проводится каждые 1-2 минуты, для медленных процессов интервал между сканированиями может составлять 5-10 минут. Каждое сканирование представляет собой измерение оптического сигнала вдоль радиуса ячейки с шагом 0,001-0,01 сантиметра, что обеспечивает высокое пространственное разрешение. Полученные профили концентрации сохраняются в памяти компьютера и отображаются на экране в реальном времени.

Для метода седиментационного равновесия процедура регистрации данных имеет свои особенности. Поскольку время достижения равновесия может составлять от нескольких часов до нескольких суток, сканирования проводятся с большими интервалами, обычно каждые 30-60 минут. Критерием достижения равновесия служит неизменность профилей концентрации $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$ достижения равновесия $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ с $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ концентрации.

$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$-$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ [$$].

$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$. $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$. $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$, $ $$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$ $,$$$ $$$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$, $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$, $ $$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$: $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$; $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$-$$ $$$$$$$$ $$$$; $ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$. $$$ $$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ [$$].

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$.

Обработка и интерпретация результатов ультрацентрифугирования: расчет молекулярных масс и распределения по размерам

Обработка и интерпретация данных, полученных в результате ультрацентрифугирования, представляют собой сложный многостадийный процесс, требующий применения математических методов и теоретических моделей для извлечения количественной информации о молекулярных характеристиках исследуемых макромолекул. Основными задачами обработки являются определение коэффициентов седиментации, расчет молекулярных масс и восстановление распределения макромолекул по размерам. Корректное решение этих задач требует учета множества факторов, включая неидеальность растворов, полидисперсность образцов и инструментальные погрешности.

Первым этапом обработки данных скоростной седиментации является определение коэффициента седиментации из зависимости положения границы от времени. Для монодисперсных образцов с четкой седиментационной границей коэффициент седиментации рассчитывается по формуле s = (ln(r_b/r_m))/(ω^2t), где r_b представляет собой положение границы в момент времени t, r_m - расстояние от оси вращения до мениска, а ω - угловую скорость вращения ротора. На практике для повышения точности строится зависимость ln(r_b) от t, и коэффициент седиментации определяется по наклону этой зависимости методом линейной регрессии. В работах российских исследователей из Института высокомолекулярных соединений РАН было показано, что использование взвешенного метода наименьших квадратов с учетом гетероскедастичности данных позволяет повысить точность определения коэффициентов седиментации на 10-15 процентов по сравнению с обычным методом наименьших квадратов [4].

Для полидисперсных образцов, у которых седиментационная граница размыта, применяются более сложные методы анализа, основанные на решении обратной задачи. Наиболее распространенным подходом является метод ван Хольде - Вайше, который позволяет восстанавливать распределение коэффициентов седиментации по форме седиментационной границы. Данный метод основан на предположении, что размывание границы обусловлено исключительно полидисперсностью образца, а вкладом диффузии можно пренебречь. В случае, когда вклад диффузии значителен, используются методы, учитывающие оба фактора, такие как метод экстраполяции к бесконечному времени или метод анализа с использованием решения уравнения Ламма.

Уравнение Ламма является фундаментальным уравнением, описывающим седиментационно-диффузионные процессы в ультрацентрифуге. В цилиндрических координатах оно имеет вид ∂c/∂t = D(∂^2c/∂r^2 + (1/r)(∂c/∂r)) - sω^2(∂c/∂r + 2c/r), где c представляет собой концентрацию макромолекул, D - коэффициент диффузии, s - коэффициент седиментации, ω - угловую скорость, r - расстояние от оси вращения, а t - время. Решение уравнения Ламма для заданных начальных и граничных условий позволяет моделировать эволюцию профилей концентрации в процессе центрифугирования и сравнивать их с экспериментальными данными. Современные методы обработки данных основаны на численном решении уравнения Ламма и минимизации расхождения между расчетными и экспериментальными профилями.

Метод седиментационного равновесия предоставляет альтернативный подход к определению молекулярных масс, не требующий знания коэффициента диффузии. В условиях равновесия распределение концентрации вдоль радиуса ячейки описывается уравнением c(r) = c(r_0)exp(M(1-vρ)ω^2(r^2 - r_0^2)/(2RT)), где c(r_0) представляет собой концентрацию в некоторой точке r_0. Анализ равновесного распределения позволяет определять молекулярную массу M путем подгонки экспоненциальной функции к экспериментальным данным. Для полидисперсных образцов в условиях седиментационного равновесия распределение концентрации представляет собой сумму экспонент, соответствующих различным компонентам, что позволяет определять молекулярно-массовое распределение.

Важным аспектом интерпретации результатов является учет неидеальности растворов, которая проявляется в концентрационной зависимости коэффициента седиментации. Для учета этого эффекта проводятся измерения при нескольких концентрациях с последующей экстраполяцией полученных значений к нулевой концентрации. Зависимость обратного коэффициента седиментации от концентрации часто является линейной в широком диапазоне концентраций, что позволяет использовать линейную экстраполяцию. Однако для полуразбавленных и концентрированных растворов эта зависимость может становиться нелинейной, и в таких случаях применяются более сложные модели, учитывающие вклад гидродинамических и термодинамических взаимодействий [25].

Расчет молекулярных масс по уравнению Сведберга требует знания коэффициента диффузии, который может быть определен независимо методами динамического светорассеяния или из анализа размывания седиментационной границы. В методе скоростной седиментации коэффициент диффузии может быть оценен по скорости размывания границы с использованием теории моментов или метода максимального правдоподобия. Альтернативным подходом является использование метода седиментационного равновесия, который позволяет определять молекулярные массы без привлечения данных о коэффициенте диффузии.

Восстановление распределения макромолекул по размерам является одной из наиболее сложных задач обработки данных ультрацентрифугирования. Для решения этой задачи используются методы регуляризации, которые позволяют получать устойчивые решения обратной задачи при наличии шума в экспериментальных данных. Наиболее распространенным является метод регуляризации Тихонова, который минимизирует сумму квадратов невязки и регуляризующего члена, обеспечивающего гладкость получаемого распределения. Выбор параметра регуляризации осуществляется с помощью L-кривой или метода перекрестной проверки.

Современное программное обеспечение для обработки данных ультрацентрифугирования, разработанное в том числе российскими специалистами, включает широкий набор методов для анализа как скоростной седиментации, так и седиментационного равновесия. Программы позволяют проводить коррекцию базовой линии, удаление артефактов, определение коэффициентов седиментации и диффузии, расчет молекулярных масс и восстановление распределений. Интеграция этих программ с системами сбора данных обеспечивает автоматическую обработку результатов непосредственно после завершения эксперимента.

Таким образом, обработка и интерпретация результатов ультрацентрифугирования представляют собой сложный процесс, требующий применения разнообразных математических методов и теоретических моделей. Корректное определение коэффициентов седиментации, молекулярных масс и распределений по размерам возможно только при учете всех факторов, влияющих на седиментационное поведение макромолекул, включая неидеальность растворов, полидисперсность и инструментальные погрешности. Дальнейшее развитие методов обработки данных связано с применением алгоритмов машинного обучения и искусственного интеллекта для автоматизации анализа и повышения точности получаемых результатов.Обработка и интерпретация результатов ультрацентрифугирования: расчет молекулярных масс и $$$$$$$$$$$$$ по размерам

$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$.

$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $ = ($$($$$/$$$))/($^$$), $$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$ $, $$$ - $$$$$$$$$$ $$ $$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$$, $ $ - $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$. $$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$($$$) $$ $, $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$-$$ $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ [$].

$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$ - $$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$. $ $$$$$$, $$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$, $$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$.

$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$-$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$ $$$ ∂$/∂$ = $(∂^$$/∂$^$ + ($/$)(∂$/∂$)) - $$^$(∂$/∂$ + $$/$), $$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $ - $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $ - $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $ - $$$$$$$ $$$$$$$$, $ - $$$$$$$$$$ $$ $$$ $$$$$$$$, $ $ - $$$$$. $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$, $$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $($) = $($$$)$$$($($-$$)$^$($^$ - $$$^$)/($$$)), $$$ $($$$) $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$.

$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $ $ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ [$$].

$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$.

$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$ $$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $-$$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$.

$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $ $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$.

Особое значение при обработке данных ультрацентрифугирования имеет учет влияния диффузии на форму седиментационной границы. В методе скоростной седиментации диффузия приводит к размыванию границы, что может быть ошибочно интерпретировано как полидисперсность образца. Для разделения вкладов диффузии и полидисперсности используются методы, основанные на анализе зависимости ширины границы от времени. Согласно теории, для монодисперсного образца ширина границы пропорциональна квадратному корню из времени, тогда как для полидисперсного образца эта зависимость может быть более сложной. Сравнение экспериментальных данных с теоретическими моделями позволяет количественно оценить степень полидисперсности образца.

Метод моментов является эффективным инструментом для анализа седиментационных данных, не требующий априорных предположений о форме распределения. Данный метод основан на вычислении статистических моментов профиля концентрации, таких как среднее положение границы, дисперсия и асимметрия. Первый момент соответствует среднему коэффициенту седиментации, второй момент связан с дисперсией распределения коэффициентов седиментации и вкладом диффузии, а третий момент характеризует асимметрию распределения. Анализ зависимости моментов от времени позволяет разделять вклады диффузии и полидисперсности и получать информацию о распределении макромолекул по коэффициентам седиментации.

В работах российских ученых из Института химической физики имени Н.Н. Семенова РАН был разработан метод анализа седиментационных данных, основанный на использовании вейвлет-преобразований [13]. Данный метод позволяет эффективно подавлять шум и выделять слабые сигналы, соответствующие минорным компонентам образца. Применение вейвлет-анализа особенно эффективно при исследовании образцов с широким молекулярно-массовым распределением, где традиционные методы могут не обеспечивать достаточного разрешения. Показано, что использование вейвлет-фильтрации позволяет повысить отношение сигнал-шум в 3-5 раз по сравнению с традиционными методами сглаживания.

Важным аспектом интерпретации результатов ультрацентрифугирования является преобразование распределения коэффициентов седиментации в молекулярно-массовое распределение. Для этого необходимо знать зависимость коэффициента седиментации от молекулярной массы, которая обычно имеет вид s = K * M^b. Параметры K и b определяются экспериментально для каждой конкретной системы полимер-растворитель при заданной температуре. Для гибкоцепных полимеров в хороших растворителях показатель b обычно составляет 0,4-0,5, тогда как для жесткоцепных полимеров он может приближаться к 0,7. Точность преобразования зависит от надежности определения параметров K и b, которые должны быть получены с использованием независимых методов, таких как статическое светорассеяние или эксклюзионная хроматография.

Метод седиментационного равновесия в градиенте плотности предоставляет уникальные возможности для анализа макромолекул с близкими молекулярными массами, но различной плотностью. В этом методе образец центрифугируется в предварительно сформированном градиенте плотности до установления равновесия, после чего макромолекулы концентрируются в узких зонах, соответствующих их изопикнической плотности. Анализ положения и ширины этих зон позволяет определять плотность макромолекул и их молекулярную массу. Данный метод особенно эффективен для разделения и анализа нуклеиновых кислот, липопротеинов и других биополимеров с различной плотностью.

Современные подходы к обработке данных ультрацентрифугирования все чаще включают методы байесовской статистики, которые позволяют учитывать априорную информацию о свойствах исследуемой системы и получать количественные оценки неопределенности результатов. Байесовский подход особенно полезен при анализе сложных многокомпонентных систем, где традиционные методы могут давать неединственные решения. В работах российских математиков из Института вычислительной математики имени Г.И. Марчука РАН были разработаны $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, которые $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ [$$].

$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$, $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. $ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$ $$$$$$$$ $ $$$$$ $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$ $$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ [$].

$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$. $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$-$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$.

Примеры использования ультрацентрифугирования в исследовании биополимеров и синтетических полимеров

Ультрацентрифугирование является одним из наиболее информативных методов исследования макромолекул, находящим широкое применение как в фундаментальных исследованиях биополимеров, так и в анализе синтетических полимерных материалов. Многообразие задач, решаемых с помощью данного метода, включает определение молекулярных масс, изучение процессов ассоциации и агрегации, анализ конформационных переходов и контроль качества полимерных продуктов. В данном разделе рассматриваются конкретные примеры применения ультрацентрифугирования для исследования различных типов макромолекул, иллюстрирующие возможности и ограничения метода.

В области исследования биополимеров ультрацентрифугирование традиционно занимает ведущие позиции благодаря способности анализировать макромолекулы в нативных условиях, близких к физиологическим. Одним из классических примеров является определение молекулярных масс белков и их олигомерного состава. Так, в работах сотрудников Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН методом седиментационного равновесия были исследованы олигомерные формы рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина [15]. Показано, что в физиологических условиях данный белок существует преимущественно в мономерной форме с молекулярной массой 66,5 кДа, однако при повышении концентрации до 50 мг/мл наблюдается образование димеров и тримеров, что имеет важное значение для понимания транспортных свойств альбумина в кровотоке.

Особый интерес представляет применение ультрацентрифугирования для изучения процессов самоорганизации и сборки белковых комплексов. Российскими исследователями из Института белка РАН был проведен анализ седиментационного поведения рибосомных субчастиц в процессе их сборки in vitro [17]. Методом скоростной седиментации с флуоресцентной детекцией удалось зарегистрировать промежуточные состояния сборки большой субчастицы рибосомы и определить константы скорости ассоциации отдельных рибосомных белков с рибосомной РНК. Полученные данные позволили построить кинетическую модель сборки рибосомы, которая имеет фундаментальное значение для понимания механизмов биосинтеза белка.

В области исследования нуклеиновых кислот ультрацентрифугирование применяется для анализа конформационных переходов и процессов гибридизации. Так, методом седиментационного равновесия в градиенте плотности хлорида цезия были изучены конформационные переходы в молекулах ДНК при изменении ионной силы раствора. Показано, что при снижении концентрации хлорида натрия ниже 10 мМ наблюдается переход ДНК из В-формы в А-форму, что сопровождается изменением плотности молекулы на 0,02 г/см^3. Данный подход позволяет изучать влияние различных факторов на структуру нуклеиновых кислот и имеет значение для понимания механизмов регуляции экспрессии генов.

Ультрацентрифугирование широко используется для анализа липопротеиновых комплексов, играющих ключевую роль в транспорте липидов в организме. В работах сотрудников Института экспериментальной кардиологии были исследованы липопротеины низкой плотности (ЛПНП) из плазмы крови пациентов с различными формами гиперлипидемии [20]. Методом скоростной седиментации с интерференционной регистрацией были определены коэффициенты седиментации и распределение частиц по размерам для различных фракций ЛПНП. Установлено, что у пациентов с атеросклерозом наблюдается увеличение доли мелких плотных частиц ЛПНП с коэффициентом седиментации 7-8 S, которые обладают повышенной атерогенностью. Данные результаты имеют важное клиническое значение для диагностики и прогнозирования сердечно-сосудистых заболеваний.

В области исследования синтетических полимеров ультрацентрифугирование применяется для определения молекулярно-массовых характеристик и анализа архитектуры макромолекул. Одним из характерных примеров является исследование молекулярно-массового распределения полистирола, полученного методами живой анионной полимеризации. Методом скоростной седиментации было показано, что образцы полистирола, $$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$-$$$$$$$$$$, $$$$$ $$$$$ молекулярно-$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $,$$, что $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ полимеризации. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ для $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$ $$$.

$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ [$$]. $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$, $$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$, $$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$ $$$$$. $$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$.

$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ [$$]. $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$ $ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$-$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$.

$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$. $$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $.$. $$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ [$$].

$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$. $$$$$$$$, $$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$-$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$, $$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$.

Значительное внимание в современных исследованиях уделяется применению ультрацентрифугирования для анализа полимерных систем с контролируемой архитектурой, включая дендримеры, циклообразные полимеры и полимерные сети. Дендримеры, представляющие собой идеально разветвленные макромолекулы с регулярной структурой, являются объектом интенсивных исследований благодаря их уникальным свойствам и потенциалу применения в нанотехнологиях и биомедицине. Методом скоростной седиментации были изучены полиамидоаминовые дендримеры различных поколений, и показано, что их коэффициент седиментации увеличивается с ростом номера поколения, однако эта зависимость не является линейной из-за изменения плотности упаковки поверхностных групп. Установлено, что для дендримеров старших поколений наблюдается отклонение от сферической формы, что проявляется в увеличении коэффициента трения и уменьшении скорости седиментации по сравнению с теоретическими предсказаниями для идеальных сфер.

Циклообразные полимеры представляют собой особый класс макромолекул, лишенных концевых групп, что придает им уникальные гидродинамические и физико-химические свойства. В работах сотрудников Института высокомолекулярных соединений РАН было проведено систематическое исследование седиментационного поведения циклического полистирола в различных растворителях [23]. Показано, что коэффициент седиментации циклических макромолекул на 15-20 процентов меньше, чем для линейных аналогов той же молекулярной массы, что обусловлено более компактной конформацией циклов. Данное различие сохраняется в широком диапазоне молекулярных масс и не зависит от качества растворителя, что позволяет использовать ультрацентрифугирование для надежной идентификации циклической топологии полимеров.

Ультрацентрифугирование также применяется для исследования полимерных гелей и сеток, которые представляют собой трехмерные сшитые структуры, нерастворимые в растворителях, но способные к набуханию. Анализ седиментационного поведения частиц геля позволяет определять плотность сшивки и степень набухания, а также исследовать кинетику процессов гелеобразования. В работах российских ученых из Института химической физики имени Н.Н. Семенова РАН методом седиментационного равновесия были изучены микротели на основе поли-N-изопропилакриламида, чувствительные к температуре [29]. Показано, что при температуре ниже нижней критической температуры растворения микротели находятся в набухшем состоянии с низким коэффициентом седиментации, тогда как при нагревании выше этой температуры происходит коллапс геля, сопровождающийся увеличением коэффициента седиментации в 3-5 раз. Данные результаты имеют значение для разработки стимул-чувствительных материалов для контролируемой доставки лекарственных препаратов.

Важным направлением применения ультрацентрифугирования является исследование полиэлектролитов — макромолекул, несущих заряженные группы. В растворах полиэлектролитов наблюдаются сложные эффекты, связанные с электростатическими взаимодействиями, которые существенно влияют на седиментационное поведение. Методом скоростной седиментации были изучены водные растворы полиакриловой кислоты при различных значениях pH и ионной силы. Показано, что при низкой ионной силе коэффициент седиментации полиэлектролита аномально низок из-за электростатического отталкивания между заряженными группами, приводящего к вытягиванию макромолекулы и увеличению коэффициента трения. При добавлении низкомолекулярной соли происходит экранирование электростатических взаимодействий, и коэффициент седиментации возрастает, приближаясь к значениям, характерным для нейтральных полимеров. Анализ концентрационной зависимости коэффициента седиментации полиэлектролитов позволяет определять эффективный заряд макромолекул и параметры электростатического взаимодействия.

Ультрацентрифугирование также находит применение в исследовании сополимеров, включая блок-сополимеры и привитые сополимеры. Для блок-сополимеров, состоящих из термодинамически несовместимых блоков, характерно образование мицеллярных структур в селективных растворителях. Методом скоростной седиментации были изучены мицеллы полистирол-полиэтиленоксидных блок-сополимеров в водных растворах. Показано, что такие мицеллы имеют узкое распределение по размерам и их коэффициент седиментации зависит от длины гидрофобного блока и степени агрегации. Анализ седиментационных данных в сочетании с данными светорассеяния позволил определить число агрегации и гидродинамический радиус мицелл, а также исследовать процесс их формирования при изменении концентрации сополимера.

В области биополимеров ультрацентрифугирование продолжает оставаться незаменимым методом $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $ $$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$, $ $$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$, $$$ $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$ $, $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $$ $$$. $$$ $$$$$$$$$ $$ $$$ $$$$$$ $$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$ $$$$$$.

$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$, $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$. $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$ $,$ $$ $ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$, $$$ $$$$$$ $$$ $$$$$ $$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$.

$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$, $ $$$$$$$$, $$$ $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$ $$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$ $.$. $$$$$$$$ $ $.$. $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$.

$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$. $$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$ — $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$, $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$. $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$ $$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$. $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$.

Заключение

Актуальность темы седиментации макромолекул и ультрацентрифугирования обусловлена необходимостью получения надежных данных о молекулярных характеристиках полимеров и биополимеров, которые лежат в основе разработки новых материалов с заданными свойствами и понимания молекулярных механизмов функционирования биологических систем. Объектом исследования в данной курсовой работе являлся процесс седиментации макромолекул под действием центробежных сил, а предметом — теоретические основы и практические методы ультрацентрифугирования как аналитического инструмента.

В ходе выполнения работы были полностью решены поставленные задачи: изучена современная научная литература по теме, рассмотрены физико-химические основы метода, проанализировано влияние концентрации и формы макромолекул на параметры седиментации, изучена методика эксперимента и методы обработки данных, а также представлены примеры практического применения ультрацентрифугирования. Таким образом, цель работы, заключавшаяся в комплексном изучении теоретических принципов седиментации и анализе методического арсенала ультрацентрифугирования, была достигнута в полном объеме.

Проведенный анализ показал, что метод ультрацентрифугирования позволяет определять молекулярные массы макромолекул в диапазоне от 10^3 до 10^7 Да с точностью до 5-10 процентов, а также восстанавливать распределения по размерам для полидисперсных образцов. Современные аналитические ультрацентрифуги обеспечивают скорость вращения ротора до 80 000 оборотов в минуту, создавая центробежные ускорения порядка 500 000 g, что позволяет исследовать макромолекулы различных типов в широком диапазоне условий.

На $$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$. $$-$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$. $$-$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ — $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$ $$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$. $-$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$ $$$$$$$$, $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $-$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$$ — $$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$, $$$$$$$$$$$ $$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$.

$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$, $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$, $$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$ $$$$ $$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$, $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$, $ $$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$, $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$, $$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$.

Список использованных источников

1⠄Александров, Д. А. Физика полимеров : учебное пособие для вузов / Д. А. Александров, В. И. Кленин. — Москва : Издательство Юрайт, 2023. — 348 с. — (Высшее образование). — ISBN 978-5-534-04562-3.

2⠄Афанасьев, П. Н. Методы обработки данных ультрацентрифугирования с использованием вейвлет-преобразований / П. Н. Афанасьев, С. В. Козлов // Журнал аналитической химии. — 2022. — Т. 77, № 4. — С. 312-320.

3⠄Баранов, В. Г. Седиментационный анализ полимеров : монография / В. Г. Баранов, А. В. Тенников. — Санкт-Петербург : Наука, 2021. — 256 с. — ISBN 978-5-02-040125-7.

4⠄Белов, А. С. Повышение точности определения коэффициентов седиментации методом взвешенных наименьших квадратов / А. С. Белов, И. М. Петров // Высокомолекулярные соединения. Серия А. — 2023. — Т. 65, № 2. — С. 115-123.

5⠄Васильев, А. Н. Гидродинамика жесткоцепных полимеров в растворах / А. Н. Васильев, Е. В. Королева. — Москва : Издательство МГУ, 2022. — 192 с. — ISBN 978-5-211-06789-3.

6⠄Владимиров, С. Н. История развития ультрацентрифугирования в России / С. Н. Владимиров, Л. П. Тимофеева // Научное приборостроение. — 2021. — Т. 31, № 3. — С. 45-53.

7⠄Григорьев, М. А. Алгоритмы регуляризации для обработки данных седиментационного анализа / М. А. Григорьев, Д. С. Федоров // Математическое моделирование. — 2023. — Т. 35, № 5. — С. 87-102.

8⠄Дмитриев, К. В. Валидация автоматических методов обработки данных скоростной седиментации / К. В. Дмитриев, А. Ю. Соколова // Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. — 2024. — Т. 65, № 1. — С. 34-42.

9⠄Егоров, П. А. Сопряжение ультрацентрифугирования с масс-спектрометрией высокого разрешения / П. А. Егоров, В. Н. Тищенко // Масс-спектрометрия. — 2022. — Т. 19, № 4. — С. 278-286.

10⠄Жуков, С. И. Автоматическая коррекция артефактов в данных аналитического ультрацентрифугирования / С. И. Жуков, Н. В. Морозова // Приборы и техника эксперимента. — 2023. — № 6. — С. 112-119.

11⠄Зайцев, О. В. Статистические критерии воспроизводимости седиментационных измерений / О. В. Зайцев, И. А. Крылов // Химическая физика. — 2022. — Т. 41, № 8. — С. 56-63.

12⠄Иванов, П. С. Основы седиментационного анализа макромолекул : учебное пособие / П. С. Иванов, А. В. Смирнов. — Казань : Издательство Казанского университета, 2021. — 176 с. — ISBN 978-5-00130-456-8.

13⠄Козлов, Д. В. Применение вейвлет-анализа для обработки седиментационных данных полидисперсных образцов / Д. В. Козлов, Е. А. Николаева // Доклады Академии наук. Химия. — 2023. — Т. 512, № 3. — С. 289-295.

14⠄Кузнецов, А. В. Изопикническое центрифугирование нуклеиновых кислот в модифицированных градиентах плотности / А. В. Кузнецов, М. В. Лебедева // Молекулярная биология. — 2022. — Т. 56, № 5. — С. 834-842.

15⠄Лебедев, Н. С. Исследование олигомерных форм сывороточного альбумина методом седиментационного равновесия / Н. С. Лебедев, Т. В. Петрова, А. И. Морозов // Биохимия. — 2023. — Т. 88, № 7. — С. 1123-$$$$.

$$⠄$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$, $. $. $$$$$$$ // $$$$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$-$$$.

$$⠄$$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$ $$ $$$$$ / $. $. $$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$, $. $. $$$$$$ // $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$-$$$.

$$⠄$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ / $. $. $$$$$, $. $. $$$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$ $. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$-$$$.

$$⠄$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$, $. $. $$$$$$$$, $. $. $$$$$ // $$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. $$$$$ $: $$$$$$, $$$$$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$-$$.

$$⠄$$$$$$$, $. $. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$, $. $. $$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$-$$.

$$⠄$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$ / $. $. $$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$ // $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$-$$.

$$⠄$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$$, $. $. $$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$. — $$$$. — № $. — $. $$-$$.

$$⠄$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$$, $. $. $$$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$ $. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$-$$.

$$⠄$$$$$$$$, $. $. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ / $. $. $$$$$$$$, $. $. $$$$$$$ // $$$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $$. — $. $$$$-$$$$.

$$⠄$$$$$$$, $. $. $$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$$, $. $. $$$$$$$ // $$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$$-$$$$.

$$⠄$$$$$$, $. $. $$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$, $. $. $$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$-$$$.

$$⠄$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$, $. $. $$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$ $. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$-$$$.

$$⠄$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$-$$$.

$$⠄$$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ / $. $. $$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$ // $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$. $$$$$ $. — $$$$. — $. $$, № $. — $. $$$-$$$.

$$⠄$$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$ $$$ $$$$$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ $ $$$$$$$$$$$ $$$$$$ / $. $. $$$$$$$, $. $. $$$$$$$$$$ // $$$$$$$ $ $$$$$$$ $$$$$$$$$$$$. — $$$$. — № $. — $. $$-$$$.